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    為了確保重組人源化膠原蛋白原材料質量可控，重組人源化膠原蛋白需參考相關行業標準進行必要的鑒別分析，可采用不同的分析方法對原材料的分子量、等電點、氨基酸序列、各種翻譯后修飾（如脫酰胺化、氧化、糖譜/糖基化修飾、脯氨酸羥基化等）進行充分鑒定，并進行相應的檢測，以確認終產物具有擬宣稱的原材料構象、聚集狀態、降解狀態及膠原蛋白高級結構。

    作為第三方檢測中心，中科檢測機構擁有CMA和CNAS認證檢測資質，檢測設備齊全，數據科學可靠，可出具國家認可的重組人源化膠原蛋白檢測報告。

    氨基酸序列及覆蓋度鑒別

    首先需明確氨基酸序列的選擇依據，如為特定氨基酸序列片段組成的，還需明確片段重復次數及依據。需采用綜合的方法測定目標膠原蛋白原材料的氨基酸序列，并與其基因序列對應的理論氨基酸序列進行比較驗證。肽段覆蓋率的檢測結果需為100%覆蓋，末端氨基酸序列檢測結果需與理論序列完全一致。可按照《重組人源化膠原蛋白》行業標準的要求，直接使用供試品檢測，并選擇適宜的酶解條件進行水解，酶解后選擇不小于5個連續氨基酸的片段為基本的序列單元進行覆蓋分析。

    如適用，目標膠原蛋白材料的理論氨基酸序列需包括二硫鍵連接方式。氨基酸序列測定還需考慮可能存在的N端甲硫氨酸（如大腸桿菌來源的膠原蛋白原材料），信號肽或前導序列。

    1）氨基酸組成

    使用各種水解法和分析手段測定氨基酸的組成，并與目的蛋白基因序列推導的氨基酸組成或天然異構體比較。如需要時需考慮分子量的大小。多數情況下，氨基酸組成分析對肽段和小蛋白可提供有價值的結構資料，但對大蛋白一般意義較小。在多數情況下，氨基酸定量分析數據可用于確定蛋白含量。

    2）氨基酸末端序列

    氨基酸末端分析用于鑒別N-端和C-端氨基酸的性質和同質性。用氨基酸序列分析儀或質譜法測定N端和/或C端氨基酸序列，其結果需符合理論預測。

    若發現目的膠原蛋白材料的末端氨基酸發生改變時，需使用適當的分析手段判定變異體的相應變異數量。需將這些氨基酸末端序列與來自目的膠原蛋白基因序列推導的氨基酸末端序列進行比較。

    肽圖鑒別

    按照《中華人民共和國藥典》 四部 通則 肽圖檢查法 第一法 胰蛋白酶裂解-反相高效液相色譜法進行測定，建立膠原蛋白原材料標準肽圖。

    推薦利用四極桿飛行時間串聯質譜儀（Q-TOF MS）建立標準肽圖，作為膠原蛋白材料的指紋圖譜，用于材料的批間一致性和穩定性評價，以及材料特異性的鑒別。

    需用合適的酶或化學試劑使所選的材料片段產生不連續多肽，應用高效液相色譜法（HPLC）或其他適當的方法分析該多肽片段。盡量應用氨基酸組成分析技術，N-末端測序或質譜法鑒別多肽片段。至少對材料成品放行來說,經驗證的肽譜分析經常是確證目的材料結構/鑒別的適當方法。具體分析方法可參考《重組膠原蛋白肽圖指紋圖譜分析》行業標準。

    分子量鑒別

    對申報醫療器械所用膠原蛋白材料可參照《中華人民共和國藥典》高效液相色譜法、“電泳法”的“第五法 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法”、基質輔助激光解析電離飛行時間質譜方法建立分子量及分布檢測方法，也可以運用其他適當技術測定分子量，如分子排阻色譜法等。需通過至少一種合理的、經驗證的方法證明其實際分子量與理論預測一致。

    高效液相色譜法目標蛋白的出峰保留時間需與參比品一致；高分辨質譜法分子量需與參比品一致；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分子量電泳條帶位置需與參比品一致。同時，需就參比品的選擇提供合理性依據。

    其他項目鑒別

    1）等電點

    按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 電泳法第六法（等電聚焦電泳法）或0542毛細管電泳法進行檢測，等電點需在標示范圍內，也可以運用其他適當的方法測定。

    2）巰基和二硫鍵

    如果目的膠原蛋白材料的基因序列存在半胱氨酸殘基時，需盡可能確定巰基和/或二硫鍵的數量和位置。使用方法包括肽譜分析（還原和非還原條件下）、質譜測定法或其他適當的方法。

    3）消光系數（或克分子吸光度）

    多數情況下，可取目的膠原蛋白材料于UV/可見光波長處測定消光系數（或克分子吸光度）。消光系數的測定為使用UV/可見光或分光光度計檢測已知蛋白含量的溶液，蛋白含量應用氨基酸組成分析技術或定氮法等方法測定。

    4）電泳圖型

    應用PAGE電泳、等電聚焦、SDS－PAGE電泳、免疫印跡、毛細管電泳法或其他適當的方法，獲得目的膠原蛋白材料的一致性，同一性和純度的電泳圖譜和數據。

    5）液相色譜圖譜

    應用分子篩色譜、反相液相色譜、離子交換液相色譜、親和色譜或其他適當方法，獲得目的膠原蛋白材料的一致性、同一性和純度的色譜圖譜和數據。