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    為了確保重組人源化膠原蛋白原材料質(zhì)量可控，重組人源化膠原蛋白需參考相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行必要的鑒別分析，可采用不同的分析方法對(duì)原材料的分子量、等電點(diǎn)、氨基酸序列、各種翻譯后修飾（如脫酰胺化、氧化、糖譜/糖基化修飾、脯氨酸羥基化等）進(jìn)行充分鑒定，并進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)，以確認(rèn)終產(chǎn)物具有擬宣稱的原材料構(gòu)象、聚集狀態(tài)、降解狀態(tài)及膠原蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)。

    作為第三方檢測(cè)中心，中科檢測(cè)機(jī)構(gòu)擁有CMA和CNAS認(rèn)證檢測(cè)資質(zhì)，檢測(cè)設(shè)備齊全，數(shù)據(jù)科學(xué)可靠，可出具國(guó)家認(rèn)可的重組人源化膠原蛋白檢測(cè)報(bào)告。

    氨基酸序列及覆蓋度鑒別

    首先需明確氨基酸序列的選擇依據(jù)，如為特定氨基酸序列片段組成的，還需明確片段重復(fù)次數(shù)及依據(jù)。需采用綜合的方法測(cè)定目標(biāo)膠原蛋白原材料的氨基酸序列，并與其基因序列對(duì)應(yīng)的理論氨基酸序列進(jìn)行比較驗(yàn)證。肽段覆蓋率的檢測(cè)結(jié)果需為100%覆蓋，末端氨基酸序列檢測(cè)結(jié)果需與理論序列完全一致。可按照《重組人源化膠原蛋白》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求，直接使用供試品檢測(cè)，并選擇適宜的酶解條件進(jìn)行水解，酶解后選擇不小于5個(gè)連續(xù)氨基酸的片段為基本的序列單元進(jìn)行覆蓋分析。

    如適用，目標(biāo)膠原蛋白材料的理論氨基酸序列需包括二硫鍵連接方式。氨基酸序列測(cè)定還需考慮可能存在的N端甲硫氨酸（如大腸桿菌來(lái)源的膠原蛋白原材料），信號(hào)肽或前導(dǎo)序列。

    1）氨基酸組成

    使用各種水解法和分析手段測(cè)定氨基酸的組成，并與目的蛋白基因序列推導(dǎo)的氨基酸組成或天然異構(gòu)體比較。如需要時(shí)需考慮分子量的大小。多數(shù)情況下，氨基酸組成分析對(duì)肽段和小蛋白可提供有價(jià)值的結(jié)構(gòu)資料，但對(duì)大蛋白一般意義較小。在多數(shù)情況下，氨基酸定量分析數(shù)據(jù)可用于確定蛋白含量。

    2）氨基酸末端序列

    氨基酸末端分析用于鑒別N-端和C-端氨基酸的性質(zhì)和同質(zhì)性。用氨基酸序列分析儀或質(zhì)譜法測(cè)定N端和/或C端氨基酸序列，其結(jié)果需符合理論預(yù)測(cè)。

    若發(fā)現(xiàn)目的膠原蛋白材料的末端氨基酸發(fā)生改變時(shí)，需使用適當(dāng)?shù)姆治鍪侄闻卸ㄗ儺愺w的相應(yīng)變異數(shù)量。需將這些氨基酸末端序列與來(lái)自目的膠原蛋白基因序列推導(dǎo)的氨基酸末端序列進(jìn)行比較。

    肽圖鑒別

    按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部 通則 肽圖檢查法 第一法 胰蛋白酶裂解-反相高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，建立膠原蛋白原材料標(biāo)準(zhǔn)肽圖。

    推薦利用四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Q-TOF MS）建立標(biāo)準(zhǔn)肽圖，作為膠原蛋白材料的指紋圖譜，用于材料的批間一致性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，以及材料特異性的鑒別。

    需用合適的酶或化學(xué)試劑使所選的材料片段產(chǎn)生不連續(xù)多肽，應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC）或其他適當(dāng)?shù)姆椒ǚ治鲈摱嚯钠巍１M量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)，N-末端測(cè)序或質(zhì)譜法鑒別多肽片段。至少對(duì)材料成品放行來(lái)說(shuō),經(jīng)驗(yàn)證的肽譜分析經(jīng)常是確證目的材料結(jié)構(gòu)/鑒別的適當(dāng)方法。具體分析方法可參考《重組膠原蛋白肽圖指紋圖譜分析》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

    分子量鑒別

    對(duì)申報(bào)醫(yī)療器械所用膠原蛋白材料可參照《中華人民共和國(guó)藥典》高效液相色譜法、“電泳法”的“第五法 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法”、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜方法建立分子量及分布檢測(cè)方法，也可以運(yùn)用其他適當(dāng)技術(shù)測(cè)定分子量，如分子排阻色譜法等。需通過至少一種合理的、經(jīng)驗(yàn)證的方法證明其實(shí)際分子量與理論預(yù)測(cè)一致。

    高效液相色譜法目標(biāo)蛋白的出峰保留時(shí)間需與參比品一致；高分辨質(zhì)譜法分子量需與參比品一致；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分子量電泳條帶位置需與參比品一致。同時(shí)，需就參比品的選擇提供合理性依據(jù)。

    其他項(xiàng)目鑒別

    1）等電點(diǎn)

    按照《中華人民共和國(guó)藥典》 四部通則 電泳法第六法（等電聚焦電泳法）或0542毛細(xì)管電泳法進(jìn)行檢測(cè)，等電點(diǎn)需在標(biāo)示范圍內(nèi)，也可以運(yùn)用其他適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定。

    2）巰基和二硫鍵

    如果目的膠原蛋白材料的基因序列存在半胱氨酸殘基時(shí)，需盡可能確定巰基和/或二硫鍵的數(shù)量和位置。使用方法包括肽譜分析（還原和非還原條件下）、質(zhì)譜測(cè)定法或其他適當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>

    3）消光系數(shù)（或克分子吸光度）

    多數(shù)情況下，可取目的膠原蛋白材料于UV/可見光波長(zhǎng)處測(cè)定消光系數(shù)（或克分子吸光度）。消光系數(shù)的測(cè)定為使用UV/可見光或分光光度計(jì)檢測(cè)已知蛋白含量的溶液，蛋白含量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)或定氮法等方法測(cè)定。

    4）電泳圖型

    應(yīng)用PAGE電泳、等電聚焦、SDS－PAGE電泳、免疫印跡、毛細(xì)管電泳法或其他適當(dāng)?shù)姆椒ǎ@得目的膠原蛋白材料的一致性，同一性和純度的電泳圖譜和數(shù)據(jù)。

    5）液相色譜圖譜

    應(yīng)用分子篩色譜、反相液相色譜、離子交換液相色譜、親和色譜或其他適當(dāng)方法，獲得目的膠原蛋白材料的一致性、同一性和純度的色譜圖譜和數(shù)據(jù)。